PCR s reverznou transkripciou - virologické metódy

PCR s reverznou transkripciou (RT-PCR)

RT-PCR – 1

RT-PCR – 2

RT-PCR – 3

RT-PCR – 4

RT-PCR – 5

RT-PCR – 6

RT-PCR – 7

RT-PCR – 8

RT-PCR – 9

RT-PCR – 1
RT-PCR – 1
RT-PCR
RT-PCR – 2
RT-PCR – 2
RT-PCR
RT-PCR – 3
RT-PCR – 3
RT-PCR
RT-PCR – 4
RT-PCR – 4
RT-PCR
RT-PCR – 5
RT-PCR – 5
RT-PCR
RT-PCR – 6
RT-PCR – 6
RT-PCR
RT-PCR – 7
RT-PCR – 7
RT-PCR
RT-PCR – 8
RT-PCR – 8
RT-PCR
RT-PCR – 9
RT-PCR – 9
RT-PCR

Využitie RT-PCR vo virológii

Využitie RT-PCR vo virológii – 1

Využitie RT-PCR vo virológii – 2

Využitie RT-PCR vo virológii – 3

Využitie RT-PCR vo virológii – 4

Využitie RT-PCR vo virológii – 5

Využitie RT-PCR vo virológii – 1
Využitie RT-PCR vo virológii – 1
Využitie RT-PCR vo virológii
Využitie RT-PCR vo virológii – 2
Využitie RT-PCR vo virológii – 2
Využitie RT-PCR vo virológii
Využitie RT-PCR vo virológii – 3
Využitie RT-PCR vo virológii – 3
Využitie RT-PCR vo virológii
Využitie RT-PCR vo virológii – 4
Využitie RT-PCR vo virológii – 4
Využitie RT-PCR vo virológii
Využitie RT-PCR vo virológii – 5
Využitie RT-PCR vo virológii – 5
Využitie RT-PCR vo virológii

Troubleshooting

Problém

Príčina

Riešenie

Málo alebo žiadny PCR produkt

Slabá kvalita alebo nedostatočné množstvo templátu

Spektrofotometricky skontrolovať kvantitu a čistotu RNA. Uchovávať RNA pri -80°C

Sekundárna štruktúra RNA je príliš komplexná

Ak je sekundárna štruktúra transkribovanej RNA príliš zložitá, na rozpletenie RNA je potrebné zvýšiť teplotu a preto treba použiť RT enzým syntetizujúci pri vyššej teplote ako bežná RT

Nevhodne zvolené primery

Vybrať vhodný typ primeru pre RT: oligo-dT primer (ak by sa mali prepísať mRNA), náhodný primer (prepis dlhých mRNA, prepis všetkých typov RNA), špecifický primer (prepis konkrétneho transkriptu)

Možná prítomnosť inhibítorov RT

Stanoviť čistotu RNA, prípadne opätovne purifikovať RNA

Zriediť templát, aby sa vyriedili inhibítory

Dávať pozor s akými tkanivami pracujeme (inhibítor môže byť napr. melanín alebo heparín). Prispôsobiť izoláciu RNA typu tkaniva

Problém s reverznou transkriptázou

RT bola inaktivovaná, treba ju skladovať pri -20°C a pri práci uchovávať vždy na ľade

Zlá koncentrácia nukleotidov

Odporúčaná koncentrácia je 0,4 mM pre každý nukleotid

Výsledný produkt je “rozmazaný” (smear)

Vysoká koncentrácia štartovacieho templátu

Zriediť templát

Príliš veľa PCR cyklov

Optimalizovať počet cyklov v PCR reakcii

Degradovaná RT

RT bola inaktivovaná, treba ju skladovať pri -20°C a pri práci uchovávať vždy na ľade

Reagencie boli uchovávané pri izbovej teplote

Uchovávať reagencie pri práci na ľade, skladovať ich pri -20°C

Produkt je „multibandový“

Reakcia prebehla za izbovej teploty (nie na ľade)

Uchovávať reagencie pri práci na ľade, skladovať ich pri -20°C

Vzorka RNA bola kontaminovaná genomickou DNA

Počas izolácie RNA opracovať vzorky Dnázou

Navrhnúť primery zohľadňujúc pozíciu intrónov a exónov (pri detekcii eukaryotických transkriptov)